تست غیر تهاجمی تشخیص پیش از تولد ناهنجاری های کروموزومی

روش تشخیص سریع اختلالات عددی کروموزومی

اختلالات عددی کروموزومی در واقع به اختلالاتی گفته می شود که در سیستم DNA به وجود می آیند و مشکلات زیادی را در شکل ظاهری افرادی که از این نوع اختلالات رنج می برند و نحوه ی عملکرد ارگان های حیاتی بدن به وجود می آورند.
اختلالات عددی کروموزومی بیشترین ارگانی را که تحت تاثیر قرار می دهند مغز است و این ناهنجاری ها قادر هستند که اختلالاتی در پیام های عصبی مغز به وجود آورند و سبب عقب ماندگی های ذهنی و جسمی شوند.اختلالات عددی کروموزمی کاملا ژنتیکی هستند و پدر و مادرهایی که ناقل این اختلال هستند می توانند این گونه ناهنجاری ها را در دوران جنینی و در زمان شکل گرفتن نطفه به فرزند خود منتقل کنند.
مجموعه راه ها و روش هایی برای جلوگیری از به وجود آمدن اختلالات عددی کروموزومی وجود دارد و یکی از این روش ها که یک روش کاملا مطمئن می باشد و تا حدود ۹۸ درصد قادر است که جلوی رخ دادن این اختلالات را بگیرد انجام دادن آزمایشات غربالگری می باشد.

تست اختلالات عددی کروموزومی برای چه کسانی است؟

انجام تست اختلالات عددی کروموزومی برای زوج هایی که در سنین بالا اقدام به بارداری می کنند ضروری می باشد، زیرا با افزایش سن کیفیت تخمک ها و اسپرم ها پایین می آید و این موضوع می تواند سبب به وجود آمدن ناهنجاری در ساختار ژنتیکی جنین شود و برای پیشگیری از به وجود آمدن این مشکل انجام تست های ژنتیک برای زوجین بسیار ضروری است. انجام تست اختلالات عددی کروموزومی برای زوج هایی که قبل از اقدام به بارداری داروهای خاصی مانند داروهای اعصاب و روان و یا داروهای ضد سرطان استفاده می کنند نیز ضروری و اجباری می باشد، زیرا این داروها بر روی نحوه ی تولید اسپرم ها و کیفیت تخمک تاثیر گذار هستند.

نحوه ی آزمایش اختلالات عددی کروموزومی

برای انجام آزمایش اختلالات عددی کروموزومی یا همان نمونه گیری ناهنجاری کروموزومی در دوران قبل از بارداری به حضور هر دو زوج نیاز است و از هر دوی آن ها آزمایش خون انجام می شود و از طریق این آزمایش تک تک DNA های موجود در سلول های زوجین را مورد بررسی قرار می دهند و در صورتی که در ساختار ژنتیکی هر کدام از آن ها اختلال ژنی وجود داشته باشد این اختلال در آزمایش نشان داده می شود و پس از آن به زوجین اطلاع داده می شود.
در صورتی که زوج های دارای شرایط خاص قبل از اقدام به بارداری در جهت انجام آزمایش اختلالات عددی کروموزومی کوتاهی کنند حتما باید در سه ماهه دوم بارداری مادر اقدام به انجام این آزمایش کند و در این زمان فقط به حضور مادر نیاز می باشد و انجام این آزمایش شامل دو مرحله است و یک مرحله شامل گرفتن خون از رگ مادر و مرحله ی بعد شامل گرفتن خون از جفت می باشد.

انجام تست Cell Free DNA و یا NIPT تحت لیسانس کمپانی Premaitha انگلستان

امروزه با استفاده از دو پلت فرم Illumina و Ion Torrent می توان ناهنجاری های کروموزومی جنین در خون مادر را مورد بررسی قرار داد. هر یک از این دو پلتفرم دارای مزایا و معایب خاصی می باشند ولی اسناد و مطالعات مختلفی که در سرتاسر دنیا انجام شده نشان میدهد هر دو پلت فرم قابلیت شناسایی ناهنجاری های کروموزومی را از طریق NGS دارا می باشند و صحت و دقت هر دو پلتفرم قابل قبول می باشد.
پلت فرم Illumina پلتفرم قدیمی تر می باشد و داده های حاصله آن زیاد است و به همین دلیل انجام تست با این روش زمانبر می باشد. در پلت فرم جدید Ion Torrent از تکنولوژی دیگری استفاده شده که با استفاده از توالی یابی کل ژنوم در کوتاهترین زمان ممکن، میزان نسبت DNA جنین به مادر را مورد ارزیابی قرار می دهد. این تکنولوژی جدید دارای تاییدیه CE-IVD می باشد که این تاییدیه دربرگیرنده، کیت های مصرفی و نرم افزارها می باشد. تمامی آنالیزهای مرتبط با این تکنولوژی در سرور منچستر انگلیس انجام شده و نتایج در قالب PDF در دسترس مراکز قرار می گیرد.

این مسئله باعث از بین رفتن خطاهای اپراتور و سلیقه های شخصی افراد در آنالیز دیتاها می شود. لازم به ذکر است امروزه شرکت Illumina طی قراردادی در نظر دارد که از کیت های Premaitha استفاده کند. ورود این تکنولوژی مدرن و کسب دانش آن، این امکان را فراهم می آورد که با حداقل هزینه و زمان ممکن، با دقت و صحت بالا خدمتی به مراجعین ارائه گردد.
تاکنون آزمایشگاه ژنتیک پزشکی فجر و دیگر مراکز معتبر کشور با استفاده از این تکنولوژی در سال های اخیر تعداد بیشماری از بیماران را مورد بررسی قرار داده اند و نتایج به دست آمده گواه این ادعا می باشد که این تکنولوژی دقت و صحت بسیار بالایی دارد.

مبانی مقدماتی تست سل فری DNA

اولین بار در سال ۱۹۹۷، DNA  آزاد موجود در گردش خون مادری با منشاء جنینی (cffDNA) مورد توجه قرار گرفت. سلولهای تروفوبلاست جفت منشاء cffDNA بوده و cffDNA  در پی پوسته ریزی سلولهای جفتی وارد گردش خون مادر می شود و در حدود چند درصد کل cell free maternal DNA  را تشکیل می دهد که این نسبت به ۱۰ الی ۲۰% در سه ماهه سوم بارداری افزایش می یابد. ت
حقیقات نشان دادند کهcffDNA  در هفته هفتم بارداری در خون مادر ظاهر شده و بلافاصله بعد از تولد (۲ ساعت پس از زایمان) از گردش خون وی از بین می رود و در خون مادر قابل تشخیص نیست. طول قطعات DNA جنین خیلی کوچکتر ازDNA  مادری بوده و در حدود ۲۰۰-۳۰۰  جفت باز (نوکلئوتید) طول دارد و بر این اساس، روش های تمایز یا افتراق cffDNA از cell free maternal DNA شکل گرفت. علاوه بر این اختلاف بین DNA جنینی و مادری، اختلافاتی در نواحی اپی ژنیک  cffDNAاز cell free maternal DNA وجود دارد.
با توجه به اهمیت موضوع افتراق cffDNA  از میان مقدار بالای cell free maternal DNA تکنیک های بسیار پیشرفته مولکولی مورد استفاده قرار می گیرد.
بررسی ها نشان داده است که در واقع DNA که در این روش مورد بررسی قرار می گیرد DNA جنین نبوده بلکه DNA جفتی می باشد. بر اساس یافته های علم جنین شناسی گامت (تخم) تشکیل شده، در عرض ۲ ‌روز پس از لقاح و تشکیل تخم، سفر خود را از طریق لوله رحمی به سمت رحم آغاز می کند که این امر با فعالیت عضلات جدار لوله میسر می شود. در همین زمان، تخم خود را مکرراً‌ تقسیم می کند تا مجموعه ای از سلول ها (بلاستومرها) به نام مورولا حاصل شود. تقسیم سلول های در حال عبور از لوله حمل تخمک ادامه یافته بطوری که تعداد آنها هر ۱۲ ‌ساعت دو برابر می شود. وقتی مجموعه سلولی فوق به رحم می رسد، شامل صدها سلول است. پس از ۶ ‌تا ۱۲ ‌روز (متوسط ۹ روز) این مجموعه سلول به رحم می رسد و در لایه آندومتر لانه‌گزینی آغاز و شروع به تقسیم سلولی می‌کند.

در اولین تقسیمات سلولی یک سری سلول‌های متفاوت که در آینده عملکرد مختلفی دارند تشکیل می‌شوند:

1. یک سری سلولها جنین را تشکیل می دهد.
2. یک سری سلولها در آینده جفت را تشکیل داده و به آن سیتوتروفوبلاست (Cytotrophoblast) می گویند.
3. یک سری سلولها هم به صورت یک لنگر باعث اتصال جنین و جفت به جدار رحمی مادر می شود که به آن سلولهای سن سیتیوتروفوبلاست (Syncytiotrophoblast) می گویند.

بنابراین در واقع تقریبأ تمام cffDNA که در خون مادر دیده می شود، در واقع منشاء آن از سلولهای جفت بوده و نه جنین و بهتر است به آن cell free placental DNA  بگوئیم. به همین دلیل در مواقعی که موزائیسم جفتی وجود دارد( زمانی که سه تایی شدن کروموزوم در بعضی سلولهای تشکیل دهنده جفت دیده می شود، در حالیکه سلولهای دیگر از جمله سلولهای جنین نرمال بوده) سبب مشاهده نتیجه مثبت کاذب می شود و در نتیجه برای تأئید تشخیص نیاز به آمنیوسنتز داریم.
هرچند cffDNA ممکن است متمایز از cell free placental DNA باشد اما در قسمت اعظم موارد، صحت نتایج آن بسیار خوب است، در حالی­که توجه به تفاوت مفهومی بین این دو اصطلاح ضروری است. به همین دلیل است که این تست هرچند صحت بالایی دارد ولی در هنگام مثبت شدن نتیجه تست، قدرت کافی برای تصمیم گیری بدون انجام تست های تشخیصی مثل آمنیوسنتز را ندارد.

نکات مهم و توصیه هایACOG  و انجمن طب مادر و جنین

1. تست Cell Free Fetal DNA تشخیصی نبوده و جایگزین CVS و آمنیوسنتز نمی باشد و به عنوان یک تست غربالگری در نظر گرفته می شود.
2. قدرت تشخیص این تست برای تریزومی ۲۱، ٪۹۹ است (مثبت کاذب کمتر از ۵/۰ درصد).
3. قدرت تشخیص آن برای تریزومی ۱۸، ۹۸-۹۷% و برای تریزومی ۱۳، ۸۰-۷۹% می باشد (مثبت کاذب کمتر از ۱ درصد).
4. بیمار با یک تست مثبت باید برای مشاوره ژنتیک و انجام تست های تشخیصی جهت تائید نتیجه این تست ارجاع داده شود.
5. علی رغم اینکه معمولا نتیجه منفی تست از ارزش تشخیصی بالایی برخوردار است ولی یک نتیجه منفی به معنی اطمینان صد در صد از سلامت جنین از نظر سندرم داون نیست.

افراد کاندید برای انجام تست

• زنان ۳۵ سال یا بالاتر
• وجود یک تست غربالگری مثبت ازجمله تست های غربالگری سه ماهه اول، دوم، اینتگریتد و یا سکوئنشیال
• نتایج سونوگرافی که نشان دهنده افزایش ریسک اختلالات آنوپلوئیدی می باشد.
• وجود سابقه قبلی برای وجود تریزومی ها و ناهنجاری های کروموزومی در خانواده یا خویشاوندان نزدیک
• وجود یک Parental balanced Robertsonian translocation که سبب افزایش ریسک تریزومی ۱۳ و ۲۱ در جنین می شود.
• زنان باردار تک قلو یا دو قلو . نباید به زنان باردار دوقلو به بالا پیشنهاد شود چرا که این تست به اندازه کافی در گروه زنان کم خطر و دو قلو به بالا مورد ارزیابی قرار نگرفته است.
• این تست قادر به تشخیص فرمهای موزائیسم، partial chromosome aneuploidy، ترانسولوکیشن و یا آنوپلوئیدی های مادری نمی باشد.
• اگر یک آنومالی ساختاری در سونوگرافی جنین مشاهده شود باید بیمار مستقیماٌ برای انجام تست های تهاجمی تشخیصی ارجاع داده شود.
• قبل از انجام تست باید سابقه خانوادگی گرفته شود تا مشخص شود آیا نیاز به انجام سایر تست های غربالگری و یا تشخیصی است یا خیر.

علل مشاهده نتایج مثبت کاذب ( جواب تست NIPT مثبت در حالیکه در آمنیوسنتز جنین سالم است)

۱- Confined Placental Mosaicism
سه‌تایی شدن کروموزوم در بعضی سلول‌های تشکیل دهنده جفت صورت می گیرد در حالیکه سلول‌های دیگر از جمله سلول‌های جنین نرمال می‌باشند، این حالت در ۲-۱% بارداری‌ها دیده می‌شود و در نتیجه وضعیتی تقریباً شایع است.

۲- Vanishing twins
وجود یک قل تحلیل رفته که باعث آزاد شدن کروموزوم های اضافی می شود (حداقل فاصله بین خونگیری و مرگ قل دوم باید ۶ تا ۸ هفته باشد).

۳- Maternal Malignancy (maternal copy number variation = CNV)
بدلیل وجود یک سری کپی نامبرهای غیرطبیعی مترشحه از سلولهای توموری که به آن maternal copy number variation = CNV می گویند

۴- از علل دیگر مثبت کاذب مواردی مثل تزریق خون یا فرآورده های خونی طی یک سال گذشته، انجام پیوند مغز استخوان و به طور کلی هر موقع منشا سومی از کروموزوم ها وجود داشته باشد می تواند در نتیجه تست تاثیر بگذارد.

علل مشاهده موارد منفی کاذب (جواب تست NIPT منفی در حالیکه در آمنیوسنتز جنین ناهنجاری دارد)

1. جنین تریپلوئید: بدلیل آنکه تمام کروموزوم ها سه تا شده اند این تست در هنگام محاسبه نسبت کروموزوم ۲۱ به کروموزوم های پایه این نسبت را ۱ به ۱ محاسبه و بعنوان جنین سالم گزارش می کند
2. موزائیسم واقعی جنینی:(True fetal mosaicism)  در این موارد بعضی از بافت های جنین به صورت موزائیسم شامل سلولهای نرمال و هم آنوپلوئید می باشد در حالیکه جفت سالم است و سلول های دارای موزائیسم در تروفوبلاست وجود نداشته ولی در جنین وجود دارند. میزان بروز این پدیده ۱:۱۰۷ می باشد.

علل مشاهده موارد عدم جواب دهی (Not Reported or NO CALL)

1. اگر تست قبل از هفته دهم بارداری به دلیل کاهش fetal fraction انجام شود
2. مصرف برخی از ترکیبات ضد انعقادی نظیرEnoxaparin، آسپرین و یا هپارین از طریق کاهش دادن فرآیند ترومبوز جفتی، کاهش هایپوکسی و کاهش التهاب در ناحیه جفت و در نهایت باعث کاهش فرآیند آپوپتوز و کاهش سطح Fetal Fraction.
3. زنان با وزن بالای ۱۰۰ کیلوگرم و کاهش fetal fraction
4. فاکتور رقت (Dilution effect)
5. بالا بودن adipocyte turnover در زنان چاق که سبب افزایش فرآیند دژنره شدنcffDNA می شود.

مزایای تست NIPT نسبت به سایر تست های غربالگری

1. مثبت کاذب کمتر: احتمال مثبت کاذب این تست زیر یک درصد برای تریزومی های ۲۱، ۱۸ و ۱۳ است.
2. قدرت تشخیص بالاتر: قدرت تشخیص به بالای ۹۹ درصد برای اختلالات کروموزوم های ۲۱، ۱۸ و ۱۳ می رسد.
3. صحت بالای تعیین جنسیت: قدرت تشخیص جنسیت در این روش بالای ۹۷% است که نسبت به بسیاری از تست های مشابه خود بالاتر است.
4. عدم وجود احتمال سقط جنین: بر خلاف روش های تشخیصی تهاجمی، به دلیل آنکه این تست فقط بر روی خون مادر انجام می شود، هیچ گونه ریسکی برای ایجاد سقط جنین ندارد.
5. عدم تاثیر پذیری از بارداری های قبلی: از آنجائیکه نیمه عمر cffDNA کمتر از ۲ ساعت است بنابراین بارداری های قبلی اختلالی در نتیجه تست ایجاد نمی کند.
6. تشخیص زود هنگام: این تست از هفته ۱۰ بارداری قابل انجام است.
7. جوابدهی سریع و بهترین پروتکل غربالگری بعد از هفته ۲۲ بارداری

گروه پرخطری که در غربالگری سه ماهه اول کاندید NIPT می شوند:

طبق پروتکل کشوری افرادی که ریسک تست های غربالگری شان در محدوده پر خطر قرار گرفته است، کاندید تست های تشخیصی هستند ولی در موارد ذیل می توان به این گروه از افراد به جای تست های تشخیصی، انجام تست NIPT توصیه می شود.

1. زنانی که وحشت زیادی از نمونه گیری تستهای تشخیصی مثل آمنیوسنتز و یا CVS دارند.
2. زنانی که زیر بار ریسک سقط تست های تشخیصی نمی روند.
3. زنانی که سابقه سقط مکرر دارند، به شرط آنکه کاریوتایپ پدر و مادر نرمال باشد .
4. زنانی که خونریزی واژینال دارند (تهدید به سقط هستند).
5. زنانی که Rh منفی هستند.
6. زنانی که HIV و یا HCV مثبت هستند.
7. زنانی که Hbe Ag مثبت و یا HBV viral load > 1,000,000 copies/ml دارند
8. زنانی که جفت پایین دارند.
9. زنانی که مالتیپل فیبروما دارند.
10. زنانی که سابقه پارگی کیسه آب (PROM) دارند.
11. مواردی که کشت آمنیوسیتها موفقیت آمیز نمی باشد.
12. مواردی که با یک جنین طلایی (جنینی که بعد از چندین سال ناباروری حاصل شده است، یا جنینی که از والدین با سن خیلی بالا حاصل شده است، یا جنینی که حاصل ART (Artificial Reproductive Technology) مثل IVF و یا ICSI  می باشد) مواجه هستیم.

در صورت داشتن هر گونه سوال در مورد انجام این آزمایش، با ما تماس حاصل فرمایید.