سنگر ( Sanger )

توالی یابی DNA (DNA Sequencing)
توالی‌یابی DNA به تکنیک آزمایشگاهی عمومی برای تعیین توالی دقیق نوکلئوتیدها یا بازها در یک مولکول DNA اشاره دارد.توالی‌یابی شامل هر روش یا فناوری است که ترتیب چهار باز آدنین، گوانین، سیتوزین و تیمین را در یک رشته از DNA تعیین می‌کند. در حال حاضر چندین روش مختلف برای توالی‌یابی DNA وجود دارد ، ظهور روش‌های توالی‌یابی سریع DNA تا حد بسیاری به پژوهش و اکتشافات در زیست‌شناسی و پزشکی کمک کرده‌است

توالی یابی Sanger

توالی یابی سانگر یک روش توالی یابی DNA “نسل اول” است. مناطقی از DNA تا حدود ۹۰۰ جفت باز به طور معمول با استفاده از روش توالی یابی سانگر یا روش پایان زنجیره ای توالی یابی می شوند. توالی یابی سانگر توسط بیوشیمیدان بریتانیایی فرد سانگر و همکارانش در سال ۱۹۷۷ ایجاد شد. در پروژه ژنوم انسانی، توالی یابی سانگر برای تعیین توالی بسیاری از قطعات نسبتا کوچک DNA انسان استفاده شد. این روش به پرکاربردترین روش تعیین توالی برای حدود ۴۰ سال تبدیل شد. سنگر اولین بار توسط Applied Biosystems در سال ۱۹۸۶ تجاری شد و نرخ خطای بسیار پایینی با دقت حدود ۹۹.۹۹ را دارد.

روش کلاسیک خاتمه زنجیره ای به یک الگوی DNA تک رشته ای، یک پرایمر DNA، یک DNA پلیمراز، تری فسفات های دئوکسی نوکلئوتید معمولی (dNTPs) و تری فسفات های دی-دئوکسی نوکلئوتید اصلاح شده (ddNTPs) نیاز دارد. این نوکلئوتیدهای پایان‌دهنده زنجیره فاقد گروه ۳′-OH هستند که برای تشکیل پیوند فسفودی‌استر بین دو نوکلئوتید لازم است، و باعث می‌شود DNA پلیمراز گسترش DNA را با ترکیب ddNTP اصلاح‌شده متوقف کند. ddNTP ها ممکن است به صورت رادیواکتیو یا فلورسنت برای تشخیص در ماشین های توالی یابی خودکار برچسب گذاری شوند

نمونه DNA برای تعیین توالی در یک میکروتیوب با پرایمر، DNA پلیمراز و نوکلئوتیدهای DNA (dCTP,dATP,dTTP,dGTP) ترکیب می شود. چهار دائوکسی نوکلئوتید پایان‌دهنده زنجیره‌ای که دارای برچسب رنگ هستند نیز در مفادیر بسیار کمتر از نوکلئوتیدهای معمولی ، اضافه می‌شوند.

مخلوط ابتدا حرارت داده می شود تا الگوی DNA دناتوره شود (رشته ها را جدا می کند)، سپس سرد می شود تا پرایمر بتواند به الگوی تک رشته ای متصل شود. پس از تنظیم شدن پرایمر، دما مجدداً افزایش می‌یابد و به DNA پلیمراز اجازه می‌دهد تا DNA جدیدی را با شروع از پرایمر سنتز کند. DNA پلیمراز به افزودن نوکلئوتیدها به زنجیره ادامه می دهد تا زمانی که به جای یک نوکلئوتید معمولی یک نوکلئوتید دی اکسی اضافه شود. در آن نقطه، هیچ نوکلئوتید دیگری نمی تواند اضافه شود، بنابراین رشته با دی اکسی نوکلئوتید به پایان می رسد.

این فرآیند در چند چرخه تکرار می شود. تا زمانی که چرخه کامل شود، تقریباً تضمین می شود که یک نوکلئوتید دی اکسی در هر موقعیت تکی از DNA هدف حداقل در یک واکنش گنجانده شده است. به این معنی که میکروتیوب حاوی قطعاتی با طول های مختلف است که به هر یک از موقعیت های نوکلئوتیدی در DNA اصلی ختم می شود (شکل زیر را ببینید). انتهای قطعات با رنگ هایی که نوکلئوتید نهایی آنها را نشان می دهد برچسب گذاری می شود.

پس از انجام واکنش، قطعات از طریق یک لوله بلند و نازک حاوی یک ماتریس ژل در فرآیندی به نام الکتروفورز ژل مویرگی (capillary gel electrophoresis) عبور داده می شوند. قطعات کوتاه به سرعت در منافذ ژل حرکت می کنند، در حالی که قطعات بلند کندتر حرکت می کنند. همانطور که هر قطعه از “خط پایان” در انتهای لوله عبور می کند، توسط یک لیزر مشخص می شود و اجازه می دهد تا رنگ متصل شده شناسایی شود.

کوچکترین قطعه (که فقط یک نوکلئوتید بعد از پرایمر به پایان می رسد) ابتدا از خط پایان عبور می کند و سپس کوچکترین قطعه بعدی (پایان دادن به دو نوکلئوتید بعد از آغازگر) و غیره. بنابراین، از رنگ‌های Dye هایی که یکی پس از دیگری بر روی آشکارساز ثبت می‌شوند، می‌توان توالی قطعه اصلی DNA را ایجاد کرد. داده های ثبت شده توسط آشکارساز شامل یک سری پیک در شدت فلورسانس متفاوت است که در کروماتوگرام زیر نشان داده شده است. توالی DNA از پیک های کروماتوگرام خوانده می شود.